Карбоцистеин ингибирует развитие риновирусной инфекции в эпителиальных клетках трахей человека

Х. Ясуда, M. Ямая, T. Сасаки, Д. Инуэ, K. Накаяма, M. Ямада, M. Асада, M. Йошида, T. Сузуки, Х. Нишимура, Х. Сасаки

Отдел Гериатрической и Респираторной Медицины, Медицинский факультет университета Тохоку Вирусный Исследовательский центр, отдел клинических исследований Национальный госпиталь г. Сендай, Япония

Резюме. Целью исследования было изучить воздействие муколитического препарата карбоцистеина на риновирусную инфекцию (РВ) в дыхательных путях.

Эпителиальные клетки трахей человека были заражены основной группой РВ — РВ14.

Инфекция РВ14 увеличила титры вируса и цитокиническое содержание супернатантов. Карбоцистеин уменьшил титры супернататного вируса, количество РНК РВ14 в клетках, подверженность клетки инфекции РВ и концентрации супернатантного цитокина, включая интерлейкины ИЛ+6 и ИЛ+8, после инфицирования РВ14. Карбоцистеин снизил экспрессию матричной РНК, кодируя молекулу межклеточной адгезии ICAM-1 (рецептор для основной группы РВ). Он также снизил супернатантную концентрацию растворимой формы ICAM-1, количество и интенсивность свечения кислотных эндосом в клетках до инфекцирования РВ и активацию ядерного фактора kB после инфицирования РВ14. Карбоцистеин снизил также супернатантные титры вируса побочной группы РВ — РВ2, хотя не снизил экспрссивность матричной РНК, кодируя липопротеиновый рецептор низкой плотности, рецептор для РВ2.

Результаты исследования показывают, что карбоцистеин ингибирует развитие инфекции РВ2, блокируя РНК внедрение вируса в эндосомы, и инфицирование РВ14 при помощи того же механизма, снижая экспрессию межклеточной адгезии+1. Карбоцистеин может уменьшить воспаление дыхательных путей, снижая выработку цитокинов при инфекции риновирусом.

Ключевые слова: эндосома, фактор межклеточной адгезии, муколитический препарат, риновирус.

Введение

Риновирусы (РВ) являются основной причиной наиболее распространенных острых респираторных инфекционных заболеваний у человека [1]. РВ также ассоциируются с обострениями бронхиальной астмы [2] и хроническими обструктивными заболеваниями легких (ХОЗЛ) [3]. Было предложено несколько механизмов действия и предполагается, что манифестация патогенеза, индуцированного РВ, является результатом действия РВ-индуцированных медиаторов воспаления [3–5].

Инфекция РВ вызывает продуцирование цитокинов, включая интерлейкины ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-8 [5–7]. Эти цитокины оказывают провоспалительное воздействие [8] и могут быть связаны с патогенезом инфекций РВ. Муколитические или мукоактивные препараты, такие как L-Карбоцистеин или моногидрат лизиновой соли карбоцистеина (SCMC-Lys), используются клинически на пациентах с ХОЗЛ и бронхиальной астмой в различных странах, включая Японию и Италию [9]. SCMC-Lys уменьшает концентрацию ИЛ-6 в конденсате дыхания у пациентов с острым ХОЗЛ [10], оказывая противовоспалительное действие. SCMC-Lys [11] и S-карбоксилметилцистеин (SCMC) [12] также снижают количество клеток зоны воспаления в дыхательных путях после попадания сигаретного дыма или диоксида серы в экспериментах на крысах, останавливают нейтрофильную активацию [13]. Это подтверждает противовоспалительное действие муколитических препаратов, включая карбоцистеин. Однако влияние карбоцистеина на продуцирование цитокинов в клетках эпителия дыхательных путей при инфекциях РВ не изучалось.

Последние отчеты показали, что основная группа РВ внедряется в цитоплазму инфицированных клеток после присоединения к их рецептору молекулы межклеточной адгезии (ICAM-1) [14,15]. Внедрение РНК основной группы РВ, РВ14, в цитоплазму инфицированных клеток предположительно осуществляется путем дестабилизации связующего рецептора и эндосомального окисления [15]. Макролидные антибиотики, такие как бафиломицин [16,17] и эритромицин [7], останавливают развитие основной группе РВ посредством уменьшения экспрессии ICAM-1 [7,17] и увеличения эндосомального уровня pH [7,16]. Глюкокортикоиды ингибируют также развитие инфекцирования РВ14 путем снижения экспрессии ICAM-1 [18]. Воспаление дыхательных путей, вызванное вирусными инфекциями, включая инфекции РВ, ассоциируется с обострениями ХОЗЛ [3,4]. SCMC-Lys предотвращает обострение ХОЗЛ [9], хотя механизмы, кроме противовоспалительного воздействия при ХОЗЛ [10], все еще не определены. С другой стороны, муколитический препарат N-ацетилцистеин снижает экспрессию ICAM-1 в легких [19]. Поэтому карбоцистеин, возможно, способен модулировать функцию клеток эпителия дыхательных путей, включая экспрессию ICAM-1, и может ингибировать развитие РВ-инфекции. Однако действие карбоцистеина на РВ-инфекцию не изучалось.

Целью исследования стало изучение действия карбоцистеина на РВ-инфекцию в клетках эпителия дыхательных путей человека. Также изучалось действие карбоцистеина на продуцирование ICAM-1 и цитокинов, на эндосомальный уровень pH с целью выяснить механизмы, препятствующие развитию РВ-инфекции.

Материал и методы исследования

Характеристики пациентов

Трахеи для клеточной культуры были получены после смерти от 25 пациентов (средний возраст 64±2 года; 10 женщин, 15 мужчин) по протоколу, утвержденному Комиссией по этическим нормам медицинского факультета университета Токоху. Среди причин смерти были острый инфаркт миокарда (n=8), злокачественная опухоль, кроме рака легких (n=8), мозговое кровотечение (n=3), обрыв аневризмы аорты (n=2), почечная недостаточность (n=2), ишемическая болезнь сердца (n=1) и злокачественная лимфома (n=1).

Клеточная культура эпителия трахей человека. Изоляция и культура клеток эпителия поверхности трахей человека были произведены в соответствии с ранее описанным способом [7, 17].

Виды вирусов, их выявление и титрирование

Вещества побочной группы РВ (РВ2) и основной группы РВ (РВ14) были подготовлены от пациентов с простудой путем инфицирования эмбриональных фибробластов человека, в соответствии с описанным ранее способом [7,17]. Выявление и титрирование РВ проводилось путем наблюдения цитопатического действия вирусов на клетки фибробласта с использованием методов, описанных ранее [7,17]. Было определено количество образца, необходимое для инфицирования 50% фибробластов (50% инфекционной дозы в тканевой культуре (TCID50)).

Выявление и количественный анализ РНК риновируса

Выявление и количественный анализ РНК РВ14 в клетках эпителия трахей человека были произведены методом ПЦР с обратной транскрипцией, как описано ранее [7,17]. Кроме того, для определения количества РНК РВ14 и снижения экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) матричной РНК (мРНК) в клетках после инфицирования РВ проводился количественный ПЦР-анализ с обратной транскрипцией в реальном времени с использованием методики Taqman (Roche Molecular Diagnostic Systems, Фостер, штат Калифорния, США), как описано ранее [17,20–22]. Для разработки образца и праймеров по руководству для оптимального выполнения ПЦР была использована программа PrimerExpress (Applied Biosystems, Фостер, штат Калифорния, США) [7, 17].

Измерение концентрации лактатдегидрогеназы

Количество лактатдегидрогеназа (ЛДГ) в культуре супернатантов измерялось с использованием метода, описанного E. Amador и соавт. [23].

Действие карбоцистеина на вирусную инфекцию

С целью изучения действия карбоцистеина на титры вирусов и содержание цитокинов в супернатантах, экспрессию ICAM-1 мРНК (рецептора для основной группы РВ) [14], липопротеинового рецептора низкой плотности (LDL) (рецептора для побочной группы РВ) [24] и экспрессию РНК РВ14 клетки были подвержены действию 10-μM-карбоцистеина или среды (PBS), начиная с 3 дней перед инфицированием РВ и до окончания экспериментов [17]. Был выбран этот период времени, т.к. максимальная концентрация SCMC в сыворотке достигала уровня >10 μМ после перорального приема внутрь 1 500 мг SCMC [25]. После этого клетки был подвержены действию РВ2 (1х105TCID50·мЛ-1), РВ14 (1х105TCID50·мЛ-1) или среды (минимально обогащенная среда Игла) на протяжении 60 минут и выращены при 33°C посредством роллинга, как описано ранее [7,17].

Протокол исследования

Для измерения динамики выделения вируса на протяжении первых 24 часов были использованы четыре отдельные культуры из одной и той же трахеи, а результаты рассчитывались по семи разным трахеям. Выращенные супернатанты были собраны через 1, 6, 12 или 24 часа после инфицирования РВ14. Собирались также и супернатанты через 48 часов после инфицирования РВ, чтобы измерить вирусный титр на протяжении 24–48 часов после инфицирования. Вирусное содержание супернатанта было выражено в TCID50 единиц на миллиметр.

Для изучения действия карбоцистеина на инфекцию РВ, в зависимости от концентрации, клетки были подвержены действию карбоцистеина при концентрациях в диапазоне 0,01–30 μM.

Действие карбоцистеина на восприимчивость к инфекции РВ14 оценивалось, как описано ранее [6,7], с использованием клеток эпителия, предварительно обработанных карбоцистеином (10 μM, 3 дня) или средой (PBS, 3 дня). Затем клетки подвергались последовательному 10-кратному разведению РВ14 или среды (минимально обогащенная среда Игла) в течение 1 ч при 33°C. Наличие РВ14 в супернатантах, собранных через 1–3 дня после инфицирования, определялось при помощи исследования эмбриональных фибробластов человека, описанного ранее, для того, чтобы оценить, произошло ли инфицирование при каждой использованной дозе РВ.

Измерение экспрессии фактора межклеточной адгезии-1 и липопротеинового рецептора низкой плотности

Исходная экспрессия ICAM-1 и рецептора LDL мРНК изучались при помощи анализа ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени, как описано ранее [7]. Концентрации растворимой формы ICAM-1 (sICAM-1) измерялись в культуре супернатантов при помощи иммуноферментного анализа.

Действие карбоцистеина на продуцирование цитокина

ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 и фактор некроза опухолей альфа (TNF-a) измерялись в культуре супернатантов при помощи специального иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) [7].

Измерение изменений в распределении кислотной эндосомы

Интенсивность флуоресценции кислотных эндосом в клетках измерялась, как описано ранее, при помощи краски LysoSensor DND-189 (Molecular Probes, г. Юджин, штат Орегон, США) [7, 17], от 100 с и до 300 с после воздействия карбоцистеином (10 μM) или средой (PBS).

Изоляция ядерных экстрактов и анализы на замедление электрофоретической подвижности

Экстрагирование ядра и анализы на замедление электрофоретической подвижности были выполнены как описано ранее [7].

Статистический анализ

Результаты выражаются как ± стандартная средняя ошибка. Статистический анализ проводился при помощи двухстороннего повторного дисперсионного анализа. Последующий вторичный анализ осуществлялся с использованием метода Бонферрони. Для всех анализов, величины p<0,05 предполагались значительными (n=количество доноров (трахеи), выращенные клетки эпителия которых были использованы).

Результаты исследований и их обсуждение

Действие карбоцистеина на риновирусную инфекцию в клетках эпителия трахей человека

Воздействие РВ2 (1х10⁵ TCID50·мЛ^-1) и РВ14 (1х10⁵ TCID50·мЛ^-1) на сливные монослои эпителиальных клеток трахей человека действию постоянно приводило к инфицированию. Через 1 час после инфицирования ни один вирус не проявился. РВ2 и РВ14 были выявлены в среде культивирования через 6 часов, а содержание вирусов поступательно увеличивалось на протяжении периода 6–24 часов после инфицирования (рис. 1a и в). Вирусные титры супернатантов, собранные через 1–2 дня после инфицирования, также содержали значительные уровни РВ2 и РВ14 (рисунок 1a и в). Супернатантные вирусные титры значительно увеличились на протяжении первых 48 часов (p<0,05 при дисперсном анализе).

Рис.1. Титры вирусов (50% инфекционной дозы в тканевой культуре (TCID50) на миллиметр) в супернатантах эпителиальных клеток трахеи человека получены: a, с) в различное время после воздействия 1х10⁵ TCID50.мЛ^-1 РВ14 (a) и РВ2 (с) в присутствии () карбоцистеина (10 μM) или среды (PBS; ); и b, d) при различных концентрациях карбоцистеина через 24–48 часов после инфицирования РВ14 (b) и РВ2 (d). Клетки были подвержены действию карбоцистеина или среды, начиная с 3 дня до инфицирования РВ14 и до окончания экспериментов. Данные представлены в виде ± стандартной средней ошибки (n=5 трахеи). * p<0,05 в зависимости от среды

Воздействие на клетки карбоцистеином значительно снизило титры РВ2 и РВ14 в супернатантах через 24 и 48 часов после инфицирования (рис. 1a и в). Кроме того, карбоцистеин ингибировал развитие инфекции РВ2 и РВ14 в зависимости от концентрации, при этом максимальный эффект был достигнут при 10 и 30 μM (рис. 1б и г).

Чтобы определить, была ли это инфекция РВ14 или цитотоксическое действие карбоцистеина на выращенные клетки, которые вызвали отделение клетки от пробирок, после того, как клетки сформировали сливной слой, количество клеток было посчитано после инфицирования РВ14 и после воздействия карбоцистеином. Количество клеток было постоянным в сливном эпителиальном слое в регулируемой среде, а коэффициент вариаций был малым (7,3%; n=15).

Ни инфекция РВ 14 (1х10⁵ TCID50·мЛ-1; 2 дня), ни воздействие карбоцистеином (10 μМ; 5 дней) не влияло на количество клеток (данные не показаны). Жизнеспособность клетки, которая оценивалась исключением трипанового синего [7], была постоянно > 96% в культуре, обработанной карбоцистеином. Инфицирование РВ14 и обработка карбоцистеином (10 μM) не изменили количество ЛДГ в супернатантах, которое составило 29±2 IU·L^-1 до инфицирования РВ14, 30±2 IU·L^-1 через 2 дня после инфицирования РВ 14 (p>0,50; n=5), и 30±2 IU·L^-1 после применения карбоцистеина (10 μM; 5 дней) (p>0,50; n=5).

Анализ действия карбоцистеина на вирусную РНК с помощью метода ПЦР

До инфицирования РВ14 не было выявлено РВ14, поддающегося обнаружению (данные не показаны). РВ14 был обнаружен через 24 часа после инфицирования (рис. 2a), и количество РНК РВ14 в клетках было выше через 48 часов, чем через 24 часа (рис. 2б). Карбоцистеин (10 μM) вызвал снижение количества РНК РВ14 в клетках через 24 и 48 часов после инфицирования (рис. 2б). Величина ингибирующего эффекта карбоцистеина через 48 часов после инфицирования была выше, чем через 24 часа (рис. 2б).

Рис. 2. a) Репликация риновируса (РВ) 14 РНК (381 bp) из эпителиальных клеток трахей человека через 0, 24 и 48 ч (полосы 13 и 4–6 соответственно) после инфицирования РВ14 при наличии 10 μM карбоцистеина (полосы 4–6) или только среды (PBS) (полосы 1–3) в соответствии с результатами анализа ПЦР с обратной транскрипцией (β-актин РНК 217 bp). Данные представлены по трем разным экспериментам. b) Соответсвующие данные получены методом ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени ( : карбоцистеин; : среда). Стандартная кривая была построена с использованием сигналов флуоресценции и цикла порога при помощи 10-кратного разведения всей РНК, экстрагированной из 1х10⁵ 50% инфекционной дозы в тканевой культуре (TCID50)·мЛ^-1 РВ14 в супернатантах незрелых фибробластах человека через 7 дней после инфицирования РВ14 (1610⁴ TCID50мЛ^-1). Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени сниженной глицеральдегид3фосфат дегидрогеназа (GAPDH) была также выполнена с использованием тех же продуктов ПЦР. Экспрессия РНК РВ была приведена к экспрессии GAPDH мРНК и отображена относительно клеток подверженных воздействию только средой через 24 часа после инфицирования. Данные представлены в виде ± стандартной средней ошибки (n=5 трахеи). * — p<0,05; ** — p<0,01 по сравнению со средой через 24 ч после инфицирования; ## — p<0,01 по сравнению со средой через 48 ч после инфицирования

Влияние карбоцистеина на восприимчивость к инфицированию риновирусом 14

Воздействие карбоцистеина на клетки снизило их восприимчивость к инфицированию РВ14. Минимальная доза РВ14, необходимая для возбуждения инфекции в клетках, подверженных воздействию карбоцистеином (10 μM; 3 дня) (2,6±0,2 log TCID50.мЛ^-1; p<0,05; n=5), была значительно выше, чем после воздействия средой (PBS) (1,8±0,2 log TCID50.мЛ^-1; n=5).

Влияние карбоцистеина на экспрессию молекул межклеточной адгезии-1

Карбоцистеин снизил исходную экспрессию ICAM-1 мРНК в клетках до инфицирования РВ14 (рис. 3a), снизил экспрессию ICAM-1 мРНК на >50% по сравнению с показателем в клетках, подверженных воздействию средой (PBS) (рис. 3a). Таким образом, карбоцистеин значительно уменьшил экспрессию в супернате sICAM-1 до инфицирования РВ14 (рис. 3б). В то же время карбоцистеин не уменьшил исходную экспрессию рецептора LDL мРНК в клетках до инфицирования РВ14 (рис. 3а).

Рис.3. a) Экспрессия ICAM1 и липопротеинового рецептора низкой плотности (LDLR) мРНК в эпителиальных клетках трахей человека через 3 дня после начала воздействия 10 μM карбоцистеиной () или средой PBS (), обнаруженные при помощи количественного анализа ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени, была нормализирована до конститутивной экспресии GAPDH мРНК. б) Растворимая концентрация ICAM (sICAM)1 в клеточных супернатантах через 3 дня после начала воздействия 10 μM карбоцистеина или средой (0 μM карбоцистеина). Среда изменялась ежедневно, а супернатанты собирались через 2–3 дня после начала воздействия. Результаты — ± стандартная средняя ошибка (n=5 трахеи). NS: незначительный (по сравнению с контролем); *: p<0,05 по сравнению со средой

Воздействие карбоцистеина на продуцирование цитокина

Карбоцистеин уменьшил исходный уровень секреции ИЛ-6 и ИЛ-8 за 24 часа до инфицирования РВ14 по сравнению с показателем в клетках, подверженных воздействию средой (PBS). Кроме того, секреция ИЛ-6 и ИЛ-8 увеличилась через 24 часа после инфицирования РВ14. Карбоцистеин также уменьшил секрецию ИЛ-6 и ИЛ-8, вызванную инфицированием РВ14, по сравнению с показателем в клетках, подверженных воздействию средой через 24 часа после инфицирования РВ14 (табл. 1).

С другой стороны, карбоцистеин затормозил базовую секрецию ИЛ-1β за 24 часа до инфицирования РВ14 по сравнению с клетками без воздействия карбоцистеином (табл.). Однако секреция ИЛ-1β через 24 часа после инфицирования РВ14 не отличалась от показателя до инфицирования (-табл.). Фактор некроза опухоли (TNF-a) не определялся в супернатантах за 24 часа до и после инфицирования РВ14.

Таблица Действие карбоцистеина на супернататнтное содержание цитокинов до инфицирования и через 24 часа после инфицирования РВ14*

Примечание. Данные представлены как ±стандартная ошибка среднего (n=5 для всех). Клетки трахей человека подвергались воздействию карбоцистеина или среды PBS (контроль).

Кислотообразующие эндосомы в эпителиальных клетках трахей человека были помечены зеленым с использованием LysoSensor DND-189. Зеленое свечение от кислотообразующих эндосом наблюдалось в зернистом образце в цитоплазме (данные не показаны), как описано ранее [7]. Со временем под действием карбоцистеина уменьшилось количество и интенсивность свечения кислотообразующих эндосом с зеленым свечением в клетках (рис. 4а). Интенсивность свечения кислотообразующих эндосом в клетках эпителия, подверженных воздействию карбоцистеином, за 300 с была значительно уменьшена (рис. 4).

Рис.4. a) Динамика изменений интенсивности зеленого свечения от кислотообразующих эндосом в эпителиальных клетках трахей человека после применения 10 μM карбоцистеина () или среды PBS (). Ингибиторы применялись во время 0. б) Интенсивность свечения кислотообразующих эндосом через 300 с после добавления 10 μM карбоцистеина или среды (контроль (C)). Интенсивность свечения кислотообразующих эндосом была измерена в 100 эпителиальных клетках трахей человека, а средняя величина выражена в процентном соотношении контрольного значения (#). Данные представлены в виде ± стандартной средней ошибки (n=5 трахеи). *: p<0,05 по сравнению с контролем.

ДНК-связывающая активность ядерного фактора (NF)-kB в эпителиальных клетках трахей человека

Исходный уровень ДНК-связывающей активности ядерного фактора (NF)-kB был постоянным, его повышение наблюдалось в клетках через 120 минут после инфицирования РВ14 (рис.5), как описано ранее [7]. Карбоцистеин снизил повышение активности NF-kB, возникшую в результате инфицирования РВ14 (рис.5).

Рис.5. ДНКсвязывающая активность ядерного фактора (NF)-kB эпителиальных клеток трахей человека до (полоса 2) и через 120 минут после (полосы 3 и 4) инфицирования РВ14 при нали чии 10 μM карбоцистеина (полоса 4) или среды PBS (полоса 3), выявленные при помощи анализа на замедление электрофоретической подвижности (полоса 1: положительный контроль (10 ng.мЛ^-1ИЛ-1β плюс 10 ng.мЛ^-1 TNF-a за 24 часа)). Клетки были подвержены действию карбоцистеина или среды от 3 дней до инфицирования и до 120 минут после инфицирования РВ14. Данные представлены по трем разным экспериментам.

Результаты исследований и их обсуждение

В настоящем исследовании было показано, что муколитический препарат карбоцистеин снизил супернатантные титры вирусов и экспрессию вирусных РНК основной группы РВ (РВ14) в выращенных эпителиальных клетках трахей человека. Предварительное воздействие карбоцистеином ингибировало экспрессию мРНК, кодируя ICAM-1 (рецептор для основной группы РВ) [14], а также супернатантные концентрации sICAM-1 до инфицирования РВ14. Поскольку минимальная доза РВ14, необходимая для возбуждения инфекции в клетках, подверженных воздействию карбоцистеином, была значительно выше, чем в клетках, обработанных средой, карбоцистеин может остановить инфекцирование РВ14, по крайней мере частично, путем снижения продуцирования его рецептора (ICAM-1), как показали наблюдения в эпителиальных клетках трахей человека, подверженных воздействию дексаметазоном [18] и эритромицином [7]. Кроме того, карбоцистеин снизил интенсивность свечения кислотообразующих эндосом в эпителиальных клетках. Величина тормозящего эффекта карбоцистеина на интенсивность свечения кислотообразующих эндосом была такой же, как бафиломицина A1 [17] и эритромицина [7]. С другой стороны, карбоцистеин снизил также супернатантные титры вируса побочной группы РВ (РВ2), хотя он не снизил экспрессию рецептора LDL м-РНК (рецептора побочной группы РВ) [24]. Карбоцистеин может также ингибировать внедрение РНК РВ2 и РВ14 через кислотообразующие эндосомы, как показано в клетках HeLa и эпителиальных клетках трахей человека, подверженных воздействию бафиломицином A1 [16,17,26] и эритромицином [18].

Как сообщалось, за обострение заболевания у пациентов с ХОЗЛ и бронхиальной астмой, отвечают различные вирусы, включая РВ, вирус гриппа и респираторно-синцитиальный вирус [2–4]. Симюнгаль и соавт. [3] описывали, что 64% обострений ХОЗЛ были связаны с простудой до начала обострений; 77 вирусов было выявлено в 39% обострений ХОЗЛ, и 39 (58%) из этих вирусов были РВ. РВ также ассоциируются с острыми приступами бронхиальной астмы [2]. Эти исследования показывают, что РВ могут быть основными патогенными микроорганизмами, отвечающими за острые приступы ХОЗЛ и бронхиальной астмы.

К патогенезу ХОЗЛ и обострениям бронхиальной астмы, включая воспаление и отек дыхательных путей, бронхоконстрикцию и гиперсекрецию слизи, применялись различные механизмы [4]. Кроме того, нейтрофильное и эозинофильное воспаление при обострениях связано с множеством медиаторов, включая ИЛ-6 и ИЛ-8, а продуцирование и секреция ИЛ-6 и ИЛ-8 стимулируются РВ14 в эпителиальных клетках дыхательных путей, как показано в настоящем исследовании и в других исследованиях [5–7]. Кроме того, ICAM'1 взаимодействует физиологически с функционально'связанным антигеном-1 лейкоцитов, выраженным на лейкоцитах, и таким образом играет жизненно важную роль в наборе и перемещении иммунных эффекторных клеток в места локального воспаления, как наблюдалось у пациентов с ХОЗЛ [27]. Поэтому вызванное инфицированием РВ14 продуцирование ИЛ-6 и ИЛ-8, которое было уменьшено карбоцистеином, что наблюдалось в настоящем исследовании, может быть связано с модуляцией воспаления дыхательных путей после инфицирования РВ и с предотвращением острых приступов хронического обструктивного бронхита, как описано ранее [9].

В настоящем исследовании карбоцистеин снизил базовое продуцирование цитокинов, включая ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-8, а также ICAM-1, до инфицирования РВ14. Инфицирование РВ14 повысило выработку ИЛ-6 и ИЛL-8, а карбоцистеин также понизил выработку ИЛ-6 и ИЛL-8, вызванную инфицированием РВ14. В супернатантах концентрация ИЛ-1β не изменилась через 24 часа после инфицирования РВ14, а TNF-a не поддавалось обнаружению через 24 часа после инфицирования РВ14, как заявлялось ранее [7,18]. Поскольку карбоцистеин уменьшил титры РВ14 в супернатантах, то тормозящий эффект карбоцистеина на инфицирование РВ14 и на само продуцирование цитокинов может быть связан с уменьшенным продуцированием ИЛ-6 и ИЛ-8 в клетках, подверженных воздействию карбоцистеином после инфицирования РВ14.

Повышенная активация NF-kB была также очевидна в клетках через 120 минут после инфицирования РВ14, как показано в предыдущих исследованиях [5,7], и карбоцистеин ингибировал эту активность. NF-kB, повысил экспрессию генов, кодирующих многие цитокины, такие как ИЛ-6, ИЛ-8 и ICAM-1 [5]. Поэтому уменьшение уровня цитокинов и ICAM-1 может быть опосредовано снижением карбоцистеином активизации NF-kB.

Предположительно, эндосомальный уровень pH регулируется вакуолярным H+- аденозинтрифосфатазой [28] и переносом ионов через антипортеры Na⁺/H⁺ [28].

Ингибиторы антипортеров Na⁺/H⁺, 5-(N-этил-N-изопропил) амилорид и N99-[5-гидроксиметил-3-(1H-пиррол-1-yl)бензоил]гуанидин метансульфонат (FR168888), а также вакуолярный H+-аденозинтрифосфатаза ингибитор бафиломицин увеличивают эндосомальный уровень pH и ингибируют развитие инфекции РВ14 в выращенных эпителиальных клетках трахей человека [7]. Хотя в подтверждение этого и нет данных, повышенный эндосомальный уровень pH, вызванный карбоцистеином, в настоящем исследовании может быть связан с тормозящим действием на вакуолярные H+-аденозинтрифосфатазы или антипортеры Na⁺/H+ в эпителиальных клетках дыхательных путей.

Последние результаты показали, что основная группа РВ внедряется в цитоплазму инфицированных клеток после привязки к ее рецептору, ICAM-1 [14]. Внедрение РНК основной группы РВ (РВ14) в цитоплазму инфицированных клеток осуществляется предположительно путем дестабилизации связующего рецептора и эндосомального окисления [15]. Тормозящее действие карбоцистеина на инфицирование РВ14 и его воздействие на эндосомальный уровень pH в настоящем исследовании соответствуют тем, что получены у бафиломицина и эритромицина в предыдущих исследованиях [7,16,17]. Кроме того, тормозящий эффект карбоцистеина на экспрессию ICAM-1 в эпителиальных клетках дыхательных путей может быть также связан с тормозящим эффектом на инфекцию РВ14, как ранее заявлялось по тормозящему эффекту бафиломицина, эритромицина и дексаметазона [7,17,18].

В настоящем исследовании ингибирующий эффект карбоцистеина наблюдался в пределах малого диапазона концентраций, и не наблюдалось полного ингибирования развития инфекции. Точная причина этого не известна. Хотя величина тормозящего эффекта карбоцистеина на супернатантные титры РВ была меньшей, чем дексаметазона и эритромицина [7,18]. Слабый тормозящий эффект карбоцистеина, скорее всего, показал малый диапазон ответной реакции и неполное ингибирование развития инфекции. Величина ингибирующего эффекта карбоцистеина на супернатантные коцентрации sICAM-1 была меньшей, чем у дексаметазона и эритромицина на протеиновую экспрессию ICAM-1 [7,18], хотя величина тормозящего эффекта карбоцистеина на интенсивность свечения кислотообразующих эндосом была такой же, как и у бафиломицина A1 [17] и эритромицина [7]. Поэтому меньшие ингибирующие эффекты карбоцистеина на экспрессию ICAM-1 могут быть частично связаны с меньшей тормозящей способностью карбоцистеина по отношению к инфекции РВ по сравнению с ингибирующими эффектами дексаметазона и эритромицина.

Карбоцистеин оказывает антиоксидантное действие, очищая реактивные промежуточные продукты кислорода [29]. На самом деле, SCMC-Lys снижает концентрацию 8-изопростана, простагландинное соединение, во время перокисления мемабранных фосфолипидов реактивными формами кислорода в конденсате дыхания пациентов с острым ХОЗЛ [10]. Кроме того, бафиломицин A1, блокатор вакуолярной H+-аденозинтрифосфатазы, уменьшает эндосомное окисление [17] в эпителиальных клетках дыхательных путей и снижает продуцирование реактивных форм кислорода в альвеолярных макрофагах [30], предполагающих связь между антиоксидантным действием и сниженным окислением эндосом. Уменьшенное продуцирование воспалительных цитокинов и ICAM-1 карбоцистеином, в настоящем исследовании, также предполагает противовоспалительное действие карбоцистеина, как показано в предыдущих исследованиях, которые продемонстрировали сниженные концентрации ИЛ-6 в конденсате дыхания, вызванные SCMC-Lys у пациентов с ХОЗЛ [10], и уменьшенное количество клеток зоны воспаления в дыхательных путях у крыс, вызванное SCMC-Lys [11] и SCMC [12].

Таким образом, это первый отчет, согласно которому муколитический препарат карбоцистеин ингибирует развитие инфекции РВ14 и снижает восприимчивость выращенных эпителиальных клеток трахей человека к этой инфекции, вероятно, путем снижения экспрессии ICAM-1 и эндосомального окисления. Карбоцистеин ингибирует также инфекцию РВ2, вероятно, путем предотвращения эндосомального окисления. Карбоцистеин снизил базовую и вызванную риновирусной инфекцией секрецию провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-6 и ИЛ-8, в супернатантах. Он может ингибировать развитие инфекции основной и побочной группы риновирусов и модулировать воспалительные реакции в эпителиальных клетках дыхательных путей после инфекции риновируса.

Литература

Stanway G. Rhinoviruses / G. Stanway // Encyclopedia of Virology; Webster R. G., Granoff A., eds. — Vol. 3. — London : Academic Press, 1994. — Р. 1253—1259.
Nicholson K. G. Respiratory viruses and exacerbations of asthma in adults / K. G. Nicholson, J. Kent, D. C. Ireland // BMJ. — 1993. — Vol. 307. — Р. 982—986.
Respiratory viruses, symptoms, and inflammatory markers in acute exacerbations and stable chronic obstructive pulmonary disease / Seemungal T., Harper-Owen R., Brownmik A. [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 2001. — Vol. 164. — Р. 1618—1623.
Sethi S. New developments in the pathogenesis of acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease / S. Sethi // Curr Opin Infect. Dis. — 2004. — Vol. 17. — Р. 113—119.
Rhinovirus stimulation of interleukin-6 in vivo and in vitro. Evidence for nuclear factor kB-dependent transcriptional activation / Zhu Z., Tang W., Ray A. [et al.] // J. Clin. Invest. — 1996. — Vol. 97. — Р. 421—430.
Infection of a human respiratory epithelial cell line with rhinovirus. Induction of cytokine release and modulation of susceptibility to infection by cytokine exposure / Subauste M. C., Jacoby D. B., Richards S. M., Proud D. // J. Clin. Invest. — 1995. — Vol. 96. — Р. 549—557.
Erythromycin inhibits rhinovirus infection in cultured human tracheal epithelial cells / Suzuki T., Yamaya M., Sekizawa K. [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 2002. — Vol. 165. — Р. 1113—1118.
Akira S. Biology of multifunctional cytokines: IL 6 and related molecules (IL1 and TNF) / Akira S., Hirano T., Taga T., Kishimoto T. // FASEB J. — 1990. — Vol. 4. — Р. 2860—2867.
Allegra L. Prevention of acute exacerbations of chronic obstructive bronchitis with carbocysteine lysine salt monohydrate: a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial / L. Allegra, C. I. Cordaro, C. Grassi // Respiration 1996. — Vol. 63. — Р. 174—180.
Exhaled interleukin-6 and 8-isoprostane in chronic obstructive pulmonary disease: effect of carbocysteine lysine salt monohydrate (SCMC-Lys) / Carpagnano G. E., Resta O., Foschino-Barbaro M. P. [et al.] // Eur. J. Pharmacol. — 2004. — Vol. 505. — Р. 169—175.
Effectiveness of carbocysteine lysine salt monohydrate on models of airway inflammation and hyperresponsiveness / Asti C., Melillo G., Caselli G. F. [et al.] // Pharmacol. Res. — 1995. — Vol. 31. — Р. 387—392.
Reduced airway inflammation and remodeling in parallel with mucin 5AC protein expression decreased by S-carboxymethylcysteine, a mucoregulant, in the airways of rats exposed to sulfur dioxide / Sueyoshi S., Miyata Y., Masumoto Y. [et al.] // Int Arch Allergy Immunol. — 2004. — Vol. 134. — Р. 273—280.
S-carboxymethyl-cysteine inhibits neutrophil activation mediated by N-formyl-methyl-leucyl-phenylalanine / Ishii Y., Kimura T., Morishima Y. [et al.] // Eur. J. Pharmacol. — 2002. — Vol. 449. — Р. 183—189.
The major human rhinovirus receptor is ICAM-1 / Greve J. M., Davis G., Meyer A. M. [et al.] // Cell. — 1989. — Vol. 56. — Р. 839—847.
Casasnovas J. M. Pathway of rhinovirus disruption by soluble intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1): an intermediate in which ICAM-1 is bound and RNA is released / J. M. Casasnovas, T. A. Springer // J. Virol. — 1994. — Vol. 68. — Р. 5882—5889.
Perez L. Entry of poliovirus into cells does not require a low-pH step / L. Perez, L. Carrasco // J. Virol. — 1993. — Vol. 67. — Р. 4543—4548.
Bafilomycin A1 inhibits rhinovirus infection in human airway epithelium: effects on endosome and ICAM-1 / Suzuki T., Yamaya M., Sekizawa K. [et al.] // Am. J. Physiol. — 2001. — Vol. 280. — Р. 1115—1127.
Effects of dexamethasone on rhinovirus infection in cultured human tracheal epithelial cells / Suzuki T., Yamaya M., Sekizawa K. [et al.] // Am. J. Physiol. — 2000. — Vol. 278. — Р. 560—571.
Oral N-acetylcysteine attenuates the rat pulmonary inflammatory response to antigen / Blesa S., Cortijo J., Mata M. [et al.] // Eur. Respir. J. — 2003. — Vol. 21. — Р. 394—400.
High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis C virus RNA / Martell M., Gomez J., Esteban J. I. [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 1999. — Vol. 37. — Р. 327—332.
Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase / Holland P. M., Abramson R. D., Watson R., Gelfand D. H. // Proc Natl Acad Sci USA. — 1991. —Vol. 88. — Р. 7276—7280.
Real time quantitative PCR / Heid C. A., Stevens J., Livak K. J., Williams P. M. //Genome Res. — 1996. — Vol. 6. — Р. 986—994.
Amador E. Serum lactic dehydrogenase activity: an analytical assessment of current assays / E. Amador, L. E. Dorfman, E. C. Wacker // Clin. Chem. — 1963. — Vol. 9. — Р. 391—399.
Members of the low density lipoprotein receptor family mediate cell entry of a minor group common cold virus / Hofer F., Gruenberger M., Kowalski H. [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. — 1994. — Vol. 91. — Р. 1839—1842.
Determination of S-carboxymethylcysteine in serum by reversed-phase ion-pair liquid chromatography with column switching following pre-column derivatization with o-phthalaldehyde / De Schutter J. A., Van der Weken G., Van den Bossche W., de Moerloose P. // J. Chromatogr A. — 1988. —Vol. 428. — Р. 301—310.
Uncoating of human rhinovirus serotype 2 from late endosomes / Prchla E., Kuechler E., Blaas D., Fuchs R. // J. Virol. — 1994. — Vol. 68. — Р. 3713—3723.
Circulating cell adhesion molecules in bronchial lavage and serum in COPD patients with chronic bronchitis / Riise G. C., Larsson S., Lofdahl C. G., Andersson B. A. // Eur. Respir. J. — 1994. — Vol. 7. — Р. 1673—1677.
Marshansky V. Proton gradient formation in early endosomes from proximal tubules / V. Marshansky, P. Vinay // Biochem Biophys Acta. — 1996. — Vol. 1284. — Р. 171—180.
Carbocysteine lysine salt monohydrate (SCMC-LYS) is a selective scavenger of reactive oxygen intermediates (ROIs) / Brandolini L., Allegretti M., Berdini V. [et al.] // Eur. Cytokine Network. — 2003. — Vol. 14. — Р. 20—26.
Bactericidal activity of alveolar macrophages is suppressed by V-ATPase inhibition / Bidani A., Reisner B. S., Haque A. K. [et al.] // Lung. — 2000. — Vol. 178. — Р. 91—104.

ФЛЮДІТЕК

Склад лікарського засобу: діюча речовина: карбоцистеїн (carbocisteine);

Флюдітек 2 %: 1 мл сиропу містить 20 мг карбоцистеїну;

Флюдітек 5 %: 1 мл сиропу містить 50 мг карбоцистеїну.

Лікарська форма. Сироп.

Фармакотерапевтична група. Засоби, які застосовують при кашлі та застудних захворюваннях. Муколітичні засоби. Карбоцистеїн. Код АТС R05С В03.

Показання для застосування. Лікування симптомів порушень бронхіальної секреції та виведення мокротиння, особливо при гострих бронхолегеневих захворюваннях, наприклад при гострому бронхіті; при загостреннях хронічних захворювань дихальної системи.

Протипоказання.

Флюдітек 2%.

Дитячий вік до 2-х років;
гіперчутливість до активної речовини або до будь-якої з допоміжних речовин;
пептична виразка шлунка та дванадцятипалої кишки у період загострення;
І триместр вагітності (у зв’язку з недостатньою кількістю даних щодо тератогенної та ембріотоксичної дії).

Флюдітек 5%.

гіперчутливість до активної речовини або до будь-якої з допоміжних речовин;
пептична виразка шлунка та дванадцятипалої кишки у період загострення;
І триместр вагітності (у зв’язку з недостатньою кількістю даних щодо тератогенної та ембріотоксичної дії).

Спосіб застосування та дози.

Флюдітек 2 %: Діти віком від 2 до 5 років - по 1 доз. ст., наповненому до відмітки 5 мл, 2 рази на день; Діти віком від 5 років до 15 років - по 1 доз. ст., наповненому до відмітки 5 мл, 3 рази на день. Флюдітек 5 %: по 1 дозувальному стаканчику, наповненому до відмітки 15 мл, 3 рази на день.

Побічні ефекти.

Флюдітек 2 %:

Ризик розвитку порушення бронхіальної прохідності у дітей віком до 2-х років (див. розділи «Протипоказання» і «Особливості застосування»).
Можливі розлади травлення (біль у шлунку, нудота, блювання, діарея). У таких випадках рекомендується зменшити дозу.
Можливі алергічні шкірні реакції, такі як кропив’янка, ангіоневротичний набряк, свербіж, еритематозні шкірні висипання (можливо, віддалені у часі).
Було зафіксовано декілька випадків фіксованого висипу, викликаного лікарським засобом.

Флюдітек 5 %:

Можливі розлади травлення (біль у шлунку, нудота, блювання, діарея). У таких випадках рекомендується зменшити дозу.
Можливі алергічні шкірні реакції, такі як кропив’янка, ангіоневротичний набряк, свербіж, еритематозні шкірні висипання (можливо, віддалені у часі).
Було зафіксовано декілька випадків фіксованого висипу, викликаного лікарським засобом.

Категорія відпуску. Без рецепта.

Реєстраційні посвідчення:

Флюдітек, сироп 5% РП № UA/8082/01/02/01 Наказ МОЗ №1422 від 01.08.2018.

Флюдітек, сироп 2% РП № UA/8082/01/01 Наказ МОЗ №1422 від 01.08.2018.

Виробник. Іннотера Шузі, Франція/Innothera Chouzy, France.

Повна інформація про препарат міститься в інструкції для медичного застосування препарату.

Матеріал для розповсюдження в рамках спеціалізованих семінарів, конференцій, симпозіумів з медичної тематики та у спеціалізованих виданнях, призначених для медичних та фармацевтичних працівників.

До списку статей